【文献分享】探索作物中的广谱抗病性
1、研究者们指出，广谱抗病性对于作物来说是一个宝贵的性状，因为它可以抵御多种病原体的侵害。文章中详细描述了不同类型的抗病基因，如R基因和QTLs，以及它们在作物育种中的应用。R基因能够使植物对特定病原体产生抗性，而QTLs则涉及对数量性状的调控，通常没有小种特异性。
2、含piz5和Pita的水稻抗病性低于单独含piz5的水稻。 活体性病原菌和死体性病原菌使用不同的策略：死体性病原体杀死宿主组织，因为它们在死细胞或垂死细胞的内容物上定植并茁壮成长，而活体性病原菌则依赖活的宿主细胞来完成它们的生命周期。
3、研究的共同第一作者为复旦大学硕士研究生畅超艳和杨淑娴，缑金营教授设计并全程指导了该工作。河南大学张学斌教授测定了ABA含量，北京大学现代农学院陈时盛研究员鉴定了广谱抗病性。该工作得到了国家重点研发计划、自然科学基金和河南大学作物逆境适应与改良国家重点实验室开放课题的资助。
载体构建入门攻略——基因编辑载体篇
1、基因编辑载体构建通常需要同时构建Cas基因表达盒和sgRNA表达盒。Cas基因的表达通常由35S或Ubi等RNA聚合酶II启动子驱动，以Nos终止子或其他终止子终止；sgRNA表达盒则由长约300 bp的U3或U6等RNA聚合酶III启动子驱动，以连续6个以上的T碱基终止。
2、构建CRISPR基因编辑载体是实践中的关键步骤，常用的eSpCas9载体包括ori（**起始点）、U6启动子、CAG增强子（增强转录活性）、FLAG标签（便于纯化）、Cas9蛋白（如SpCas9和SaCas9）、转录终止子（如bGH poly(A) terminator）等元件。在植物基因编辑中，需构建Cas9基因表达盒和sgRNA表达盒。
3、构建DNA重组体前，首先选择合适的载体，并通过适当的限制酶切割载体DNA，形成线性分子，以便与目的基因片段进行连接。在阅读质粒图谱时，需先识别**起始位点、筛选标记、多克隆位点，以及外源DNA插入片段的大小。
4、构建表达载体的步骤包括选择合适的载体，限制酶切割载体和目的基因片段，连接后转化受体细胞。
突变体库如何创建
1、首先，物理化学诱导法，如在植物中广泛应用的EMS（乙基甲磺酸乙酯），通过自交方式鉴定突变，虽然过程耗时，但能产生大量的变异材料。T-DNA插入技术因其易于鉴定，成为创建高效突变体库的首选。RNAi技术则能够靶向特定基因家族，提供更为精细的调控手段。CRISPR-Cas系统的核心在于其精确切割基因序列的能力。
2、大规模突变体库的建立是正向遗传学研究的核心，方法包括物理化学诱变、T-DNA或转座子插入、基因沉默等。其中，EMS诱变虽广泛用于植物，但鉴定过程复杂，需建立群体；而T-DNA或转座子插入则通过已知序列快速鉴定。
3、总的来说，EMS诱变技术在植物遗传改良中扮演着关键角色，通过精确控制处理条件，可以有效地构建和筛选出具有特定性状的突变体库，为植物育种提供了强大的工具。
基因编辑-载体构建之CRISPR/CAS9
CRISPR-Cas9基因编辑载体构建通常包含以下组件：ori（**起始点）、U6启动子、CAG增强子、FLAG标签、Cas9核酸内切酶、bGH poly(A)终止子、AmpR启动子和AmpR氨苄抗性基因等。这些组件共同作用，实现Cas9蛋白的高效表达和sgRNA（引导RNA）的高效合成，为基因编辑提供有力工具。
CRISPR/Cas9是一种基于RNA指导的Cas9核酸酶的基因编辑技术，它允许科学家们精确地对基因组进行修改。这种技术最早出现在细菌和古细菌中，作为它们对抗病毒和质粒的一种免疫机制。CRISPR/Cas9系统中，crRNA与tracrRNA结合形成双链RNA，指导Cas9蛋白在特定位置切断双链DNA。
基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas9技术，是一种革命性的遗传操作手段，它允许科学家在DNA序列上进行精确的修改。这一技术基于细菌免疫系统中的CRISPR-Cas系统，通过Cas9核酸酶在gRNA的引导下，对特定基因组位置进行精准切割，形成突变，以实现基因的敲除、特异突变引入或基因敲入等改造。
CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因编辑工具，其原理基于细菌和古细菌的免疫防御机制。Cas9蛋白是一种RNA引导的核酸酶，通过与CRISPR RNA（crRNA）和转录激活RNA（tracrRNA）结合，形成复合物，能识别并切割特定DNA序列，产生双链断裂（D**），进而进行基因编辑。
关于CAS9
Cas9是一种CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具。Cas9是CRISPR-Cas9系统中的核心部分，被广泛应用于基因编辑领域。以下是关于Cas9的 基本概述：CRISPR-Cas9系统是一种源自细菌的天然免疫系统，可针对外来入侵的DNA进行识别和切割。
CRISPR/Cas9技术，作为细菌和古细菌演化出的一种强大免疫防御机制，其核心在于利用Cas9核酸酶和gRNA的协同作用进行精确的DNA剪切。Cas9结合gRNA，通过gRNA上的靶点序列在目标基因组上定位并切断DNA双链，引发遗传物质的改变。
Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并进行有效的靶向DNA剪切。主要分为两个组成部分Cas9核酸酶和gRNA 两部分。
Cas9的适应性使其在商业和科研中占据主导地位，尤其在哺乳动物应用中表现突出。Cas12则是在2015年被发现的CRISPR新成员，它是一种单RNA引导的内切酶，使用简单，体积比Cas9小，切割效率虽稍逊于Cas9，但其独特的非特异性切割能力使其在诊断领域展现出潜力。
以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。专利授权 2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。
如何提升crispr效率
1、显著提高了CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas9-VQR系统在水稻中的基因组编辑效率。通过试验，水稻中的编辑效率最高可达到近80%，提升幅度最高可达8倍。
2、CRISPR系统通过引导Cas蛋白实现基因组编辑，其效率检测至关重要。首先，T7E1酶切分析法，利用错配识别快速检测突变，但半定量且有假阳性风险。Sanger测序配合TIDE分析提供初步筛查，但精度有限。而高通量测序技术如扩增子和GUIDE-seq则更为精准和高效。
3、为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率，比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA （sgRNA）的不同载体设计对其打靶效率的影响。